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云南pcr引物设计承诺守信「英瀚斯」厉行节约的意思
2023-09-06 02:01  浏览:39
5分钟前 云南pcr引物设计承诺守信「英瀚斯」[英瀚斯2eefa30]内容:

分子实验介绍——荧光定量PCR检测

荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。这些方法究竟孰优孰劣,斯坦福大学医学院遗传学系的研究人员对市场上三个主流的外显子组测序平台进行了比较。Sybr green在低样本量时成本较低,目前选用的较多。

SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。分子生物学检测技术是现代分子生物学与分子遗传学取得进步的结晶,是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程:细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。

结果示例:

图 A 基因扩增曲线图;B 基因扩增溶解曲线图;C mRNA相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果,溶解曲线可以看出引物识别特异性情况,通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。

逆转录病毒构建及包装

逆转录病毒(Retrovirus)是一类RNA病毒。在逆转录酶的作用下,以病毒RNA为模板合成cDNA再通过DNA、转录、翻译等过程形成病毒颗粒。逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白表达系统,由逆转录病毒载体、辅助载体(表达病毒包装需要的蛋白质)和包装细胞系组成。逆转录病毒载体在外源基因表达、基因沉默、、生物制药等得到广泛的应用。外显子测序外显子组测序(exome-seq)是对定向富集的基因组DNA进行高通量测序,它能够以相对低的费用对人类外显子组进行拷问。逆转录病毒载体主要优点:转染范围广,可以各种细胞类型,转入的外源基因可完全融合,对细胞率高,细胞不产生病变,可建立细胞系长期持续表达外源基因。

逆转录病毒载体系统共有两部分组成:包装细胞系和缺陷病毒本身。在逆转录病毒载体中,去除了正常的蛋白编码序列而保留了和包装信号,通过分子技术将目的基因插入此载体上,而包装细胞系能提供病毒载体包装成病毒粒子所需的结构蛋白。当重组病毒载体导入包装细胞后,缺陷病毒载体和包装细胞的互补作用共同完成病毒装配,该病毒颗粒可其它宿主细胞,此时目的基因进入该细胞并整合到细胞基因组中,导致插入序列在宿主细胞中表达,产生目的蛋白。将含有靶基因mRNA同源互补序列的RNA(DoublestrandRNA,dsRNA)导入细胞后,能够特异地识别该mRNA,引起mRNA的降解,从而导致相应的功能缺失。宿主细胞不能像包装细胞那样为缺失结构基因的逆转录病毒提供结构蛋白,因而在宿主细胞内不会产生新的毒颗粒,保证了该载体在生物制品领域的生物安全性问题。

凝胶阻滞迁移电泳检测服务(EMSA)

凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。依据实验需要,设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗ti等参照物,基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚bing烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中有不同迁移率的原理,当转录因子与特异的DNA或RNA结合后,其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA,从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。以zui小点面积30,平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。

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