8分钟前 江苏PCR实验室服务为先「英瀚斯」[英瀚斯2eefa30]内容：
基因组甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:
1.高l效液相色谱(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -种比较传统的方法,是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。随着系统的压强的增加，其分辨率增l高。故而能够定量测定基因组整体水平DNA甲l基化水平。C使用Imageproplus软件对A蛋白灰度检测，A蛋白表达变化统计图。该方法由Ruo等1980年首l次报道。过程是将DNA样品先经盐酸或氢l氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5 mC/(5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲l基化水平。这是一种检测DNA甲l基化水平的标准方法。
2.高l效毛细管电泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)这是一-种利用窄孔熔融石英毛细管来从复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下不同分子的由于其所带电荷，大小，结构以及疏水性等不同而相互分开。ELISA是一种结合抗原、抗ti特异性反应和酶对底物高xiao催化作用的高敏感性免yi学实验技术。用HIPCE方法处理DNA水解产物来确定5mC水平，简便，经济且敏感性高。
凝胶阻滞迁移电泳检测服务（EMSA）
凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一种研究DNA/RNA结合蛋白和其相关的DNA/RNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。依据实验需要，设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗ti等参照物，基于DNA-蛋白质或RNA-蛋白质复合体在聚bing烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中有不同迁移率的原理，当转录因子与特异的DNA或RNA结合后，其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA，从而检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。microRNA芯片:RNA干扰(RNAInterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒qin犯的防御机制。
二、操作步骤：
1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需恢复至室温后抽滤脱气；
2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压（压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力）。防止柱中进入气泡，影响分离效果；
4. 当柱子限压在 0.3MPa，或者在限压状态下流速很低时，pH valve 中的 Restirtor 可以切换成 Off line，即显示 By-pass 状态；
5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 W1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；
6. 进样阀「Inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「Load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 W1 阀口处换回原来接头阀门。
7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系统。长期不用，层析柱应保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；
8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；
20.Primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3'端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3'端5个碱基有2个以上的G或C。
◆如果可能避免在3'端1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退火温度Tm控制在 58-60C 左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。
